Cientistas americanos anunciam técnica nova de mudança de DNA

Cientistas da Universidade de Harvard e do Instituto do MIT e Harvard desenvolveram uma nova classe de editor de base de DNA que pode alterar a estrutura genômica para ajudar a reparar o tipo de mutações que representam a metade das mutações pontuais associadas à doença humana. Estas mutações estão associadas a distúrbios que variam de cegueira genética a anemia falciforme a distúrbios metabólicos e fibrose cística.

Uma equipe de pesquisadores liderada por David Liu, professor de química e biologia química da Universidade de Harvard e um membro do instituto central do Broad, desenvolveu um editor de base de adenina (ABE) capaz de reorganizar os átomos em uma adenina alvo (A), uma das as quatro bases que compõem o DNA, para se assemelhar à guanina (G) em vez disso, e depois enganando células para corrigir a outra cadeia de DNA para tornar a mudança permanente. O resultado é que o que foi um par de bases A • T é alterado para um par de bases G • C. O novo sistema foi descrito em um artigo publicado no jornal Nature.

Os primeiros autores Holly Rees (à esquerda), David Liu e Nicole Gaudell. Foto de Casey Atkins

Além de Liu, o estudo foi liderado por Nicole Gaudelli, um colega pós-doutorado no laboratório de Liu; Alexis Komor, ex-pós-médico do laboratório de Liu, que agora é professor assistente na Universidade da Califórnia, San Diego; estudante de pós-graduação Holly Rees; e ex-pós-doutores Ahmed H. Badran e David I. Bryson.

O novo sistema transforma os pares de bases A • T em pares de base G • C numa posição-alvo no genoma das células vivas com eficiência surpreendente, disseram os pesquisadores, muitas vezes excedendo 50%, com virtualmente nenhum subproduto detectável, como inserções, deleções, translocações ou outras conversões de base para base. O editor de base de adenina pode ser programado por pesquisadores para direcionar um par de bases específico em um genoma usando um RNA guia e uma forma modificada de CRISPR-Cas9 que já não corta o DNA de cadeia dupla.

Ser capaz de fazer esse tipo de conversão é particularmente importante porque aproximadamente metade das 32.000 mutações pontuais associadas à doença já identificadas pelos pesquisadores são uma mudança de um par de bases G • C para um par de bases A • T.

Liu disse que uma mudança particular é incomum comum em parte porque cerca de 300 vezes ao dia em cada célula humana, uma reação química espontânea converte uma base de citosina (C) em uracilo (U), que se comporta como timina (T). Embora existam mecanismos naturais de reparo celular para corrigir essa mudança espontânea, a maquinaria não é perfeita e ocasionalmente não consegue fazer o reparo. O resultado pode ser a mutação do par de bases G • C para um par de bases A • U ou A • T, o que pode levar a certas doenças genéticas.

 

 

“Por causa desta leve instabilidade química do Cs em nosso genoma, cerca de 50 por cento das mutações pontuais patogênicas em seres humanos são do tipo G • C a A • T”, disse Liu. “O que desenvolvemos é um editor de base, uma máquina molecular, que de maneira programável, irreversível, eficiente e extremamente limpa pode corrigir essas mutações no genoma das células vivas. Para alguns sites-alvo, essa conversão inverte a mutação associada a uma determinada doença “.

Uma adição importante às tecnologias de edição do genoma, o editor adenine base junta-se a outros sistemas de edição básica recentemente desenvolvidos no laboratório de Liu, como BE3 e sua variante melhorada, BE4. Usando esses editores de base, os pesquisadores agora podem corrigir todas as chamadas mutações de “transição” – C para T, T para C, A para G ou G para A – que, em conjunto, representam quase dois terços de todos os pontos causadores de doenças mutações, incluindo muitas que causam doenças graves que atualmente não possuem tratamento. Pesquisas adicionais são necessárias para permitir que o editor de base de adenina alveja tanto quanto possível o genoma, como Liu e seus alunos fizeram anteriormente através de variantes de engenharia do BE3.

À primeira vista, Liu disse que pode parecer que o desenvolvimento do editor de base de adenina seria um processo direto: basta substituir a enzima no BE3 que executa a “cirurgia química” para transformar C em U com uma que poderia converter A em I ( inosina), um nucleotídeo que se comporta de forma semelhante a G. Infelizmente, ele disse, não há uma enzima desse tipo que funcione no DNA, então Liu e colegas fizeram a escolha incomum de desenvolver o seu próprio DNA adenina desaminase, uma enzima hipotética que converteria A para Eu no DNA.

“Esta não foi uma pequena decisão, porque temos uma regra de longa data no laboratório de que, se o primeiro passo do seu projeto for evoluir o material inicial que é necessário para o resto do projeto começar, esse não é um projeto muito bom , porque são realmente dois grandes projetos “, disse Liu. “E se você tiver que passar anos apenas para obter o material de partida para o resto do seu projeto, essa é uma estrada difícil.

“Neste caso, sentimos que o impacto potencial foi significativo o suficiente para quebrar a regra, e eu sou muito afortunado que Nicole [Gaudelli] tenha coragem suficiente para enfrentar o desafio”.

As apostas foram particularmente altas para Gaudelli, disse Liu, “porque se não pudéssemos completar o primeiro passo e evoluir um DNA adenina desaminase, então o segundo passo não iria a qualquer lado, e teríamos pouco que mostrar para todo o trabalho “.

“A evolução das proteínas ainda é em grande parte uma arte, tanto quanto é uma ciência”, disse Liu. “Mas Nicole tem incríveis instintos sobre como interpretar os resultados de cada estágio da evolução das proteínas, e após sete gerações de evolução, ela conseguiu evoluir um editor de base A de alto desempenho, que chamamos ABE7.10”.

A estrada que levou ao editor da base adenina exigiu mais do que apenas evoluir o material inicial. Após um ano de trabalho e várias tentativas iniciais que resultaram em nenhuma edição de DNA detectável de pares de base A •, a equipe começou a ver os primeiros reflexos de sucesso, disse Liu. Após três rodadas de evolução e engenharia, os editores da base adenina estavam trabalhando de forma enganosa, até que a equipe descobriu que o sistema só trabalharia em certas sequências de DNA.

“Nesse ponto, poderíamos ter puxado o gatilho e relatado um editor de base que funciona bem apenas em determinados sites, mas achamos que os requisitos de seqüência realmente limitariam sua utilidade e desencorajariam outros de moverem o projeto, então nós voltamos para o poço da evolução. Alteramos as seleções para forçar um editor base que processaria todos os sites, independentemente da sua seqüência “, disse Liu. “Essa foi uma chamada difícil, porque nesse ponto, trabalhamos bem durante um ano no projeto, e foi muito emocionante que estivéssemos vendo qualquer edição de base em pares de bases A • T em DNA”.

A equipe reiniciou seus esforços com várias rodadas adicionais de evolução e engenharia, testando seus editores de base adenina contra 17 sequências genéticas que incluíam todas as combinações possíveis de bases de DNA em torno do alvo A, disse Liu. A versão final ABE7.10 editada sites com uma eficiência média de 53 por cento, e produziu virtualmente nenhum produto indesejável.

Para demonstrar o potencial do editor de base adenina, Liu e colegas usaram ABE7.10 para corrigir uma mutação que causa hemocromatose hereditária em células humanas. Eles também usaram ABE7.10 para instalar uma mutação em células humanas que suprime uma doença, recriando a chamada “mutação britânica” encontrada em indivíduos saudáveis ​​que normalmente desenvolveriam doenças do sangue como anemia falciforme. A mutação, em vez disso, faz com que os genes da hemoglobina fetal permaneçam ativos após o nascimento, protegendo-os das doenças do sangue.

Embora o desenvolvimento do editor de base adenina seja um desenvolvimento emocionante na edição de base, mais trabalho permanece antes que a edição básica possa ser usada para tratar pacientes com doenças genéticas, incluindo testes de segurança, eficácia e efeitos colaterais.

Com informações de Harvard Gazette